qPCR绝对定量检测

一、qPCR绝对定量服务简介

实时荧光定量PCR(qPCR)技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。随着PCR反应的进行，PCR产物不断积累，荧光信号也会相应的增强，每个循环收集一次荧光信号，然后通过荧光强度的变化来对PCR反应进行实时的监测，得到荧光扩增曲线，计算待测样品初始模板的量。

绝对定量是用已知量的标准曲线推算出某个样品中目的基因的拷贝数。可用于环境样品中目的基因的绝对拷贝数检测。由于所用目的基因标准品的浓度是已知的，该标准品中目的基因的量可以被精确测定，因此可将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板来进行 qPCR反应，以标准品中目的基因拷贝数的对数作为横坐标，以Ct值作为纵坐标，可绘制出一条标准曲线。对未知样品进行定量时，根据未知样品的Ct值，即可从标准曲线方程中推算出样品中目的基因的拷贝数。

二、qPCR绝对定量实验流程

DNA提取及定量 → PCR引物设计、合成及调试 → 制备目的基因质粒标准品→ 荧光定量PCR实验（扩增曲线、溶解曲线、标准曲线）→ 数据分析与处理

三、qPCR绝对定量送样要求

1、土壤、沉积物、淤泥取样后保存于-80℃冰箱，每个样本≥2g

2、目的基因信息（包括基因序列或Genbank accession number、物种来源、目的基因丰度、特殊处理等）

3、送样时使用干冰，以保证运输过程中的低温条件（干冰的挥发消耗量约为4-5公斤/天，天气炎热时适当增加）