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qPCR、ELISA

实时荧光定量PCR(qPCR)检测

 

实时荧光定量PCR(qPCR)技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时监控反应过程。随着PCR反应的进行,PCR产物不断积累,荧光信号也会相应的增强,每个循环收集一次荧光信号,然后通过荧光强度的变化来对PCR反应进行实时的监测,得到荧光扩增曲线,计算待测样品初始模板的量。

多米诺生物使用高精度荧光定量PCR仪对基因表达量进行检验,该技术特异性强、效率高,目前已得到广泛应用,运用该技术,可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量等检测分析。

一、实时荧光定量PCR服务简介

1、绝对定量

首先创建与检测样品目的基因具有相同序列的标准品,使用已知浓度的标准品制作标准曲线,然后使用标准曲线对未知浓度的检测样品进行绝对量(起始拷贝数)分析。

2、相对定量(mRNA表达量分析)

相对定量是对待测样品进行某一特定基因的检测并确定待测基因相对于内参基因,以及该特定基因在实验组中相对于对照组的相对表达差异,多米诺可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探针法两种检测方法,一般采用2-ΔΔCt法进行数据计算,每个样本做三个复孔。

二、实时荧光定量PCR实验流程

总RNA提取及定量 → PCR引物设计及反转录 → 荧光引物设计(SYBR Green 荧光染料法)/探针设计(TaqMan 荧光探针法) → 荧光定量PCR实验(扩增曲线、溶解曲线、表达量差异分析) → 数据分析与处理

三、实时荧光定量PCR送样要求

1、新鲜取样或保存完好的样品,组织样品用液氮速冻后保存于-80℃冰箱,细胞也可以在加入Trizol后保存于-80℃,后续样品需用干冰寄送。

细胞≥10^6,组织≥300mg,血液≥1ml;DNA或RNA体积≥20ul,浓度≥100ug/ul

2、目的基因信息(包括基因序列或Genbank accession number、物种来源、目的基因丰度、特殊处理等)

四、实时荧光定量PCR结果交付

质检胶图、引物序列、原始数据及实验报告。

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