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科研动态

饲料中黄曲霉毒素B1的测定

黄曲霉毒素(Aflatoxin,AF)最早被发现于1960年,是黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)的次级代谢产物,种类繁多,目前已分离鉴定出12种以上,常见的有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、B2a、G2a、BM2a和GM2a等,其中以黄曲霉毒素B1分布最广、毒性最强、危害最大。黄曲霉毒素B1存在于土壤,动植物各种坚果,特别是花生和核桃中,在大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素。一般以热带和亚热带等南方高温、高湿地区受污染最为严重,食品中黄曲霉毒素的检出率比较高。

1、测定原理

  试样中的黄曲霉毒素B1经黄曲霉毒素B1提取溶液提取后,再经三氯甲烷萃取、三氟乙酸衍生,衍生后的黄曲霉毒素B1采用反相高效液相色谱-荧光检测器进行测定,外标法定量。

2、实验试剂

  黄曲霉毒素B1提取溶液:量取84 mL乙腈,加入到16 mL水中,混匀。  黄曲霉毒素B1衍生溶液:分别量取20 mL三氟乙酸,加入70 mL水中,混匀后加入10 mL冰乙酸,混匀。  

流动相:黄曲霉毒素B1标准储备溶液(1000 g/ mL):精确称取黄曲霉毒素B对照品(纯度≥98%)10.0 mg,用10 mL乙腈完全溶解,配制成黄曲霉毒素B1含量为1 000 ug/mL 的标准储备溶液。

  黄曲霉毒素B1标准工作溶液:取1.0 mL黄曲霉毒素B1标准储备溶液,用乙腈定容至100 mL,浓度为10 ug/mL。再取此稀释液1.0 mL,用乙腈定容至100 mL,则浓度稀释为100 ng/mL的标准工作溶液。

3、样品处理   

  采集有代表性的试样,将试样粉碎,过0.42 mm分析筛,混匀后装入密闭容器中。称取5.00 g(精确到0.01 g)试样置于100 mL带塞锥形瓶中,加人25.0 mL曲霉毒素B1提取溶液,室温下200 r/ min 振荡提取60 min,用中速滤纸过滤,取10.0 mL滤液于50 mL具塞离心管中,加入10.0 mL 三氯甲烷萃取,旋涡混合1 min,静置分层后,取下层萃取液于15 mL具塞离心管中,50℃水浴氮气吹干。加入200 uL乙腈水溶液复溶,然后加入700 uL黄曲霉毒素B1衍生溶液,加塞混匀,40 ℃下恒温水浴衍生反应75 min后,经0.22 um 微孔滤膜过滤后,待测。

4、样品测定

(1)色谱条件

  a)色谱柱:C18色谱柱,长250 mm,内径4.6 mm,粒径5um;

  b)柱温:30℃;

  c)流动相:分别量取20 mL甲醇、10 mL乙腈和70 mL水,混匀;

  d)流速; 1 mL/ min;

  e)激发波长:365 nm;发射波长:440 nm;

  f)进样体积:20uL。

(2)标准系列溶液测定

 分别取0.9 mL黄曲霉毒素B1标准系列溶液于7个10 mL具塞离心管中,50℃水浴氮气吹干,用200 uL乙腈水溶液复溶,然后加700 uL黄曲霉毒素B1衍生溶液,加塞混匀,40 ℃下恒温水浴衍生反应75 min,再经0.22 um微孔滤膜过滤后,待测。

(3)上机测定

  在上述液相色谱参考条件下,将衍生后的黄曲霉毒素B1标准系列溶液、试样溶液注入高效液相色谱仪,测定相应的响应值(峰面积),采用单点或多点校正,外标法定量。黄曲霉毒素B标准溶液色谱图见下图。

5、结果计算

   试样中黄曲霉毒素B1的含量以质量分数w表示,单位为微克每千克(ug/kg),按下式计算:

   W=0.9*ρ*V1/m/V2

  式中:  

  ρ—试样衍生液在标准曲线上对应的黄曲霉毒素B1含量,单位为纳克每毫升(ng/mL);

  V1—提取液的总体积,单位为毫升(mL);

  V2—用于萃取的提取液体积,单位为毫升(mL);

  m —试样的质量,单位为克(g);

  0.9—衍生后的试样溶液体积,单位为毫升(mL)。

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