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科研动态

小麦籽粒蛋白组分测定

蛋白质含量与小麦品质密切相关,要深入了解决定小麦营养和加工品质的机制及其调控措施,不仅要研究蛋白质总量,还要研究蛋白质的组分。小麦籽粒蛋白质是由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4种蛋白组成,前两种蛋白决定其营养品质,后两种决定加工品质。

一、实验原理

  植物种子蛋白质的85 %~90 %是储藏蛋白,只要分布在胚乳或子叶中。植物种子种的蛋白质根据其溶解特性划分四中类型,即清蛋白溶于水和稀盐溶液;球蛋白不溶于水,但溶于稀盐溶液;醇溶蛋白不溶于水,但溶于70 %~80 %的乙醇中;谷蛋白不溶于水、醇中,但溶于稀酸、稀碱中。根据蛋白质组分在不同溶剂中的溶解性,可按顺序用蒸馏水、稀盐、乙醇、稀碱分别提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白,分别收集提取液,再用考马斯亮蓝G-250或其他方法测定各蛋白组分。

二、样本处理

  及时剥出麦穗中的籽粒,在120℃烘箱中杀青15min,再于65℃下烘至恒重,用粉碎机粉碎,过60目筛,测定蛋白质组分含量。

三、蛋白质组分提取3.1清蛋白提取

  万分之一天平准确称取样品 0.5g,置于10ml离心管中,加入蒸馏水3ml,用玻璃棒搅拌均匀,2ml蒸馏水冲洗玻璃杯,在水浴振荡器上 220rpm振荡30min,4000rpm离心15min,取上清夜移入50的容量瓶。向离心管的沉淀中加入5ml蒸馏水搅拌,再离心和振荡。同一离心管的样品重复提取3次,每次离心的上清夜都移到同一容量瓶内,最后用蒸馏水定容至50ml,待测。

3.2球蛋白提取

  向离心管中的残渣加入3ml 10%NaC1溶液搅拌均匀,再用2ml 10%NaCl溶液冲洗玻棒,振荡和离心步骤同清蛋白。最后用10%NaCl溶液定容至50ml,待测。

3.3醇溶蛋白提取

  向离心管中的残渣加入 3ml 70%CH;CHOH溶液搅拌均匀,再用2ml 70%CH:CH,OH溶液冲洗玻棒,220 rpm振荡1h,4000rpml 离心15 min,上清液移入50ml容量瓶,重复提取3次,最后用70%CH3CH2OH定容至50ml,待测。

3.4谷蛋白提取

  向离心管中的残渣加入3ml 0.2% NaOH溶液搅拌均匀,再用2ml 0.2% NaOH溶液冲洗玻棒,220 rpm振荡1h,4000rpml离心15 min,上清液移入50ml容量瓶,重复提取3次,最后用0.2%NaOH溶液定容至50ml,待测。

四、标准曲线制备4.1考马斯亮蓝 G-250

  准确称取100 mg考马斯亮蓝G-250,溶于95 %CH3CH2OH溶液中,加入85 %的(W/V)磷酸100 ml,最后用蒸馏水定容至1000 ml,过滤后于4℃冰箱保存备用。

4.2 牛血清蛋白标准液

  准确称取牛血清蛋白100 mg,均匀溶于1L蒸馏水中,取此溶液5 ml加蒸馏水稀释至50 ml,即为0.1 mg/ml 牛血清蛋白标准液。

4.3 标准曲线绘制

  分别吸取0.0mL、0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL牛血清蛋白标准液,置于10 ml具塞试管中,各加蒸馏水至1 ml,再加入5 ml的考马斯亮蓝G-250溶液,将试管内的溶液混匀,室温下放置2 min,以1 ml蒸馏水加5 ml的考马斯亮蓝G-250溶液为空白,在595 nm下测定溶液吸光度,绘制标准曲线。

五、样品测定

  分别吸取清蛋白提取液、球蛋白提取液、醇溶蛋白提取液、谷蛋白提取液1.0mL于试管中,再加入5 ml的考马斯亮蓝G-250溶液,将试管内的溶液混匀,室温下放置2 min,以空白管凋零,在595 nm下测定溶液吸光度,根据吸光度查标准曲线或按回归方程计算,求出样品中的蛋白质含量。

六、结果计算

  样品中的各蛋白组分含量按下式计算:X=C×Vt÷m÷Vs  

式中,C:查标准曲线得到的蛋白质浓度值;Vt:提取液总体积(mL);Vs:测定时加样量(mL);m:样品重量(g)。

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