游离氨基酸测定

一、测定原理

  样品中游离氨基酸经6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯衍生,使之生成具有荧光的衍生物,经液相色谱分离,用荧光检测器测定,保留时间定性,外标工作曲线法定量。

二、实验试剂
1.无水硼砂;
2.无水磷酸氢二钠;
3.无水磷酸二氢钾;
4. 盐酸三乙胺;
5.磷酸;
6.乙腈: 色谱纯;
7. 6- 氨基喹啉:N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(CAS号:148758-94-2) :纯度>98%;
8.氨基酸标准品:丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、胱氨酸(Cys)、γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酰胺(Glm)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、茶氨酸(The)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val),纯度均>98%;
9.快速定量滤纸;
10. 0.45 μm水相滤膜;
11. 0.45 μm有机相滤膜。

三、试样提取
  准确称取样品约2.0 g(精确至0.000 1 g)于250 mL锥形瓶中,加入200 mL沸水冲泡，95C水浴加热,每隔5min混匀一次,提取10min后取出,趁热抽滤,滤液冷却至室温后,用水定容至250mL,混匀后取适量样品溶液,经0.45μm水相滤膜过滤后待测。
 

四、标准溶液配制
4.1混合氨基酸标准储备液配制
  称取各氨基酸标准品适量(精确到0.01mg),用水溶解,配制成混合溶液。混合标准溶液中的茶氨酸和其他20种氨基酸的浓度分别为5.00μmol/mL和1.25μmol/mL。
4.2混合氨基酸标准工作液配制
  准确吸取2mL混合氨基酸标准储备液至5mL容量瓶中,用水稀释定容至刻度,混匀，即得到第一份标准溶液。将第一份标准溶液用水逐级稀释,制成总共7个不同浓度的系列混合标准工作溶液。7个浓度的混合标准工作溶液中茶氨酸及其他20种氨基酸的浓度分别为:2000.00nmol/mL和500.00 nmol/mL,1 000. 00 nmol/mL和250. 00 nmol/ mL, 500.00 nmol/mL和125. 00 nmol/mL,250.00 nmol/ mL和62.50 nmol/ mL, 125.00 nmol/ mL和31.25 nmol/ mL, 62.50 nmol/ mL和15.63 nmol/ mL,31.25 nmol/ mL和7.81 nmol/ mL。

五、样品衍生化
  移取制备好的样品溶液或标准工作溶液10μL于洁净的玻璃内插管中,加入衍生用缓冲溶液70μL,然后加入衍生试剂20 μL,涡旋混合10 s,加盖密封于进样瓶中,在室温下静置1 min,转移至55 C烘箱中加热10 min,取出待测。

六、液相色谱条件
1.色谱柱:C18, 5μm,4.6 mmX 250 mm;
2.荧光检测器参数:激发波长250 nm,发射波长395 nm;
3.柱温:35 C;
4.流速:1 mL/ min;
5.进样体积:5 μL。
6.流动相A:准确移取800 mmol/L磷酸二氢钾95mL,800 mmol/L磷酸氢二钠储备液5 mL,1 mol/L的盐酸三乙胺水溶液10 mL,54 mL乙腈,于1 000 mL容量瓶中,用水定容至1 000 mL,混匀,超声脱气10 min。
7.流动相B:准确移取800 mmol/L磷酸二氢钾100mL到1 000 mL容量瓶中,加入水250 mL,加入乙腈500 mL,用水定容至1 000 mL,混匀,超声脱气10 min后备用。
8.进样体积:5 μL。
9.流动相梯度洗脱程序：

七、样品测定

  标准溶液注入高效液相色谱仪进行测定，分别得到21种氨基酸的峰面积。分别以各氨基酸峰面积为纵坐标，浓度为横坐标,建立标准工作曲线。样品溶液与标准工作溶液在相同条件下进行上机测定,分别得到样品中各氨基酸色谱峰面积,代入标准工作曲线计算含量。

八、结果计算

样品中各游离氨基酸含量计算公式:

W=C*V*M*10-^6/m

式中:

W-试样中各氨基酸组分的含量,单位为毫克每100克(mg/100 g)。

C-试样溶液中由标准工作曲线计算出的氨基酸浓度,单位为纳摩尔每毫升(nmol/mL)。

V-试样总体积，单位为毫升(mL)。

M一氨基酸的摩尔质量,单位为克每摩尔(g/mol)。

m-试样质量,单位为克(g)。