BBP法测定磷分级

土壤磷库包括有机磷库和无机磷库两部分，其中,无机态磷是土壤磷素的主要赋存形态，土壤有机磷可直接或间接地为植物提供磷素营养，除部分可溶态有机磷可直接被植物吸收利用，大部分有机磷只有通过酶的矿化分解作用才能成为作物可利用磷。在整个土壤磷素化学循环过程中，由于土壤中磷素的迁移转化作用，土壤磷组分间处于动态平衡状态，各组分间存在着一定程度的相互影响和制约，任何形态土壤磷组分的变化都会或多或少地引起有效磷水平的波动，因此土壤磷素分级可以更好地了解土壤磷素赋存形态变化。

1.土壤BBP磷分级方法

长期以来，植物营养学家一直致力于土壤样本的化学分析与作物生长之间关系的研究，确定土壤养分的有效形态，研究不同磷素组分的转化特点及其化学、微生物学影响因素，以期提高土壤磷素的植物有效性,促进农业的快速发展。其中速效磷通常作为表征土壤有效磷的重要指标，相关研究证明土壤速效磷含量与土壤有效磷之间存在明显的相关关系。这部分磷主要来自土壤中全部水溶性磷、部分吸附态磷、有机磷和某些沉淀态磷。但忽略了不同形态磷对有效磷的贡献，需要对磷素进行更加深入的研究，从而出现多种土壤磷素分级方法。用来估算土壤有效磷数量、不同土壤磷组分库数量及其对土壤有效磷的补充能力。适宜的土壤磷素分级方法的提出对评价土壤有效磷素的含量以及土壤供磷状态的分析具有重要意义。

Deluca等在2015年建立一种从生物学角度出发反映生物介导的磷素有效性变化和景观尺度上土壤磷素状态变化的分级方法( the biologically-based phosphorus，BBP法)，模拟植物、微生物磷素获取机制来探究土壤可利用磷素组分，对不同土壤中植物介导的根际过程的影响进行评价。该方法利用四种提取剂进行平行提取,将磷素分为CaCl2-P、Citrate-P、Enzyme-P、HCI-P四个组分，分别模拟作物不同机制所吸收的土壤磷素组分，其中 CaCl2-P模拟能直接被根际截留或自由扩散的磷酸根离子，即为土壤可溶性磷；Citrate-P模拟能够被有机酸活化释放和无机弱结合的的磷，为黏土部分吸收或弱结合于无机沉淀物中的活性无机磷组分;Enzyme-P模拟易被微生物和植物分泌的酸性磷酸酶和植酸酶矿化活性有机磷部分;HCI-P模拟植物和微生物氢质子活化的最大潜力磷库，表示吸附到矿物表面或存在于无机物析出物中的中稳性无机磷组分。该方法操作简单，价格低廉，方便高效，直接恰当的评价了土壤各赋存形态磷素的生物有效性。

2.BBP法测磷分级步骤       

（1) 提取步骤     

称取0.5000 g待测新鲜土壤于15 mL离心管中，分别加入10 mL提取剂(0.01 mol/LCaCl2、0.01mol/L柠檬酸、0.02 EU/mL酶试剂以及1 mol/LHCI)，充分混匀，置于往复振荡箱中室温条件180 rpm振荡3小时以提取土壤磷素，到时后于5000 rpm离心10 min，将浸提上清液过0.45 um滤膜后测定。酶提取过程，原始方法的提取液仅含酸性磷酸酶和植酸酶，为使有机磷组分的获取更加接近作物的吸收过程，在原始方法的基础上添加微生物来源的碱性磷酸酶，使得所活化提取的有机磷组分更加全面和具有代表性，并且提取过程中以纯水代替醋酸钠缓冲溶液。鉴于植酸酶自身含磷，在使用前于室温条件下用透析袋对植酸酶透析5 d以去除植酸酶中的磷。采用钼蓝法测定磷含量，对于高磷含量样品(Citrate-P、HCI-P),对其进行适当稀释后测定。

 (2）测定步骤

分光光度计预热30 min，调节波长到883 nm，以蒸馏水调零。取2mL待测液加入 1 mL去离子水和 1 mL混合显色剂，充分混匀，室温显色 30 mim后利用分光光度计于883 nm 处测定吸光度。

3.土壤磷素有效性及其影响因素

磷的生物有效性是指土壤磷素对作物需求的供应过程,只有在根际微区内能够移动到植物根部的磷离子或能被植物吸收的磷酸根养分才是实际有效的养分。并且对于任何土壤，植物可利用的磷素组分都不是一个固定不变的数值。植物及土壤类型参数在不同程度上决定了作物对不同磷库的特定获取吸收机制。土壤有效磷组分是能够被植物直接或间接吸收利用的那部分土壤磷，主要来自土壤溶液中的磷酸盐，以及能通过各种转化方式向土壤溶液中补充磷素的有机和无机形态磷，其含量由土壤内一系列的生物和理化因素共同调节。

土壤磷素转化及其生物有效性受到诸多因素的影响,如土壤类型、土壤性质、施肥措施、气候海拔、作物种植方式等因素的不同会出现明显差异。研究表明，土壤磷浓度与土壤有机质与全氮含量存在正相关关系。有机质分解过程中产生酸物质（有机酸、腐殖酸等)，土壤磷素活化释放，氮素则促进植物根系生长，从而低分子有机酸、酶等物质，使得磷素有效性增加。

长期施磷对土壤耕层全磷、无机磷和有机磷有显著影响,其中石灰型土壤含量较高的Ca2-P、Ca8-P溶解性较好，为土壤活性磷的主要来源;随着土壤养分的积累及土壤理化性质的变化，Ca10-P等难溶态磷部分转化为有效态。亦有研究表明，长期轮作与施肥对土壤Fe-P、CaCl2-P、Ca2-P以及Ca8-P等不同形态磷素含量具有显著影响。

气候海拔对土壤磷素有效性的影响主要表现在温度、降水方面。相关研究表明，在降水量充足的条件下，土壤有效磷形态分布比例增大。

pH值对土壤磷素化学形态及含量的控制有重要作用，其影响程度的高低与土壤本身含有的离子和矿物的浓度相关，主要包括与磷酸根离子竞争络合、与吸附位点的阴离子和磷酸根离子结合的Fe、Al和 Mn等金属离子。土壤酸碱环境直接关系到土壤中无机磷的存在形态，从而影响磷的有效性和土壤的供磷力。酸性土壤中活性铁、铝对磷的吸附固定作用和沉积作用，可降低土壤中磷的有效性和供磷力。施用石灰调节土壤的酸碱度至中性，可降低无机磷组分中的Fe-Р和Al-P，提高Ca-P，可有效地改善土壤的供磷能力，也能提高土壤的有效磷测定值。

植物根系和土壤微生物性质主要影响土壤有机磷的植物有效性。土壤中普遍存在能够溶解难溶性磷酸盐矿物的解磷菌，并且土壤微生物和作物根系还可分泌磷酸酶，对有机磷的矿化释放具有重要作用。磷酸酶是专一性的磷酸酯水解酶，可以催化磷酸酯的水解反应和磷酸基团转移反应，在土壤的生物释磷过程中具有关键作用。